دليل المشتري لتقنية PCR

تعد تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عنصرًا أساسيًا في عدد لا يحصى من مختبرات البحث والاختبار، في مجموعة من المجالات بما في ذلك الطب الحيوي والتشخيص السريري واختبار علم الأحياء الدقيقة الغذائي والطب الشرعي الجنائي.تستخدم هذه التقنية الأساسية التدوير الحراري لتسهيل سلسلة من التفاعلات التي يتم فيها تكرار عينة الحمض النووي بسرعة وبشكل كبير لإنتاج ملايين أو مليارات النسخ من التسلسل.عند الحصول على نظام PCR جديد، من المهم مراعاة الأهداف النهائية لتطبيقك، ودقة وكفاءة معدات التدوير الحراري وقدرة الجهاز ومرونته.تقدم هذه المقالة نظرة عامة على الخيارات والميزات المختلفة المتاحة لأنظمة PCR للمساعدة في تضييق نطاق النظام المناسب لتطبيقك.

1. PCR مقابل qPCR مقابل dPCR

في حين أن جميع أنظمة PCR تقوم بتكرار الحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل، إلا أن هناك منهجيات مختلفة تستخدمها أنظمة مختلفة لتحقيق نتائج محددة.ومن بين هذه الطرق المختلفة PCR القياسي، وPCR الكمي (qPCR) وPCR الرقمي (dPCR).

تُستخدم عادةً أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية لتضخيم الحمض النووي لإجراء المزيد من الاختبارات والاستخدامات النهائية؛بمعنى ما، يتم استخدام هذه التكنولوجيا كوسيلة لتوليد منتج نهائي وليس كوسيلة اختبار تحليلية بحد ذاتها.لا يمكن قياس الحمض النووي المضخم إلا بعد تفاعل PCR إذا كان كاملاً، وليس في الوقت الحقيقي، وبالتالي يشار إلى هذه الطريقة أحيانًا باسم PCR لنقطة النهاية.يُستخدم المنتج النهائي لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي بشكل شائع في الاستنساخ والتسلسل، ويمكن أيضًا فحصه باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي للتأكد من وجود التسلسلات المستهدفة وكميتها النسبية بدقة منخفضة (استنادًا إلى كثافة النطاق).

للحصول على تقدير كمي أكثر سرعة ودقة لكمية التسلسل المستهدف الموجود في العينة، يستخدم PCR الكمي (qPCR)، المعروف أيضًا باسم PCR في الوقت الحقيقي، مجسات الفلورسنت أثناء عملية التضخيم لمراقبة كمية الحمض النووي الموجودة بعد كل دورة حرارية.من خلال ملاحظة عدد الدورات اللازمة لتلبية عتبة معينة من شدة التألق، يمكن للمحلل تحديد كمية الحمض النووي في المادة الأولية عند مقارنة النتائج بمنحنى قياسي.يمكن لـ qPCR أيضًا تأكيد وجود أو عدم وجود تسلسل مستهدف بسرعة أكبر من PCR لنقطة النهاية، وبالتالي يتم استخدامه في التطبيقات التشخيصية مثل اكتشاف SARS-CoV-2 (باستخدام النسخ العكسي لتحويل الحمض النووي الريبي الفيروسي أولاً إلى cDNA).

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (dPCR) طريقة كمية أخرى تتم فيها تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في آلاف غرف التفاعل المنفصلة، ​​ويمكن تحديد العدد المطلق لجزيئات الحمض النووي في العينة الأصلية بناءً على عدد غرف التفاعل التي تنتج إشارة فلورية بعد اكتمال التضخيم .على عكس qPCR، لا يتم إجراء قياسات الفلورسنت في الوقت الحقيقي وليس هناك حاجة إلى منحنى قياسي لقياس الحمض النووي في العينة.في حين أن dPCR يأتي عادةً بإنتاجية محدودة وتكاليف أعلى من qPCR، فهو أكثر دقة وحساسية ودقة في قياس الحمض النووي ومفيد بشكل خاص في تطبيقات مثل الكشف عن الطفرات النادرة وتعدد أشكال النوكليوتيدات الفردية (SNPs).

إن تحديد ما إذا كان سيتم اختيار PCR لنقطة النهاية (النوعي/شبه الكمي) مقابل الطريقة الكمية (qPCR أو dPCR) يعد أمرًا واضحًا نسبيًا عندما تفكر في طلبك، ولكن الاختيار بين qPCR وdPCR قد يكون أكثر دقة.يتميز qPCR بإنتاجية عالية وفعال من حيث التكلفة وحساس بدرجة كافية للعديد من التطبيقات، ولكن قد يكون dPCR خيارًا أفضل إذا كان القياس الكمي المطلق مع حدود الكشف المنخفضة أمرًا بالغ الأهمية.

2. أهمية التحكم في درجة الحرارة

إن قدرة أجهزة التدوير الحرارية على ضبط درجة حرارة العينات والتحكم فيها بدقة وكفاءة هي ما يمكّن من نجاح تفاعلات التضخيم ويجب أن يكون محورًا رئيسيًا لاختيار أي نظام PCR.قد توفر الأنظمة المختلفة قدرات مختلفة فيما يتعلق بمعدلات المنحدر، وتوحيد درجة الحرارة والدقة، والقدرة على تحقيق تدرجات درجة الحرارة عبر الكتل الحرارية للمساعدة في تحسين طريقة PCR.

يشير معدل المنحدر إلى سرعة تغيرات درجة الحرارة بين خطوات التدوير الحراري ويتم التعبير عنه عادةً بالدرجات المئوية في الثانية (درجة مئوية/ثانية) في مواصفات الجهاز.قد توفر الشركات المصنعة معلومات عن الحد الأقصى لمعدلات المنحدر ومتوسط ​​معدلات المنحدر بالإضافة إلى التمييز بين معدلات المنحدر الأعلى (التدفئة) ومعدلات المنحدر السفلي (التبريد) للأداة.بشكل عام، تتوافق معدلات التدرج الأعلى مع أوقات تشغيل أسرع، ولكن يجب على المشترين توخي الحذر بشأن التركيز على معدلات التدرج القصوى دون فحص المقاييس الأخرى المتعلقة بسرعة الأداة.قد يحقق الجهاز أعلى معدل انحدار فقط لفترة قصيرة من الوقت، وسيعكس متوسط ​​معدل الانحدار بشكل أفضل وتيرة التغيرات في درجات الحرارة.في حين أن مواصفات معدل المنحدر قد تعطي فكرة عامة عن مدى سرعة تشغيل أدوات معينة، ابحث، عندما يكون ذلك ممكنًا، عن البيانات المتعلقة بأوقات التشغيل الفعلية الموضحة على الجهاز للحصول على صورة واقعية عن كيفية ترجمة معدلات المنحدر العالية إلى تحليلات سريعة.

تعد دقة درجة الحرارة والاتساق أيضًا أمرًا أساسيًا للتفاعلات الناجحة، وبينما تم تصميم جميع أجهزة التدوير الحرارية لإنتاج درجات الحرارة اللازمة لتفاعل البوليميراز المتسلسل، فإن بعض الميزات يمكن أن توفر درجة أعلى من الثقة، وهو أمر بالغ الأهمية للتطبيقات التي قد تكون فيها العينات محدودة وتكون النتائج موثوقة أهمية قصوى كما هو الحال في التشخيص السريري والطب الشرعي.يعد التحكم الدقيق في درجة الحرارة أمرًا بالغ الأهمية أيضًا عند استخدام جهاز PCR للتقنيات الحساسة مثل تحليل الذوبان عالي الدقة (HRM).يمكن أن يضمن الغطاء الساخن توحيدًا أفضل لدرجة الحرارة في جميع أنحاء أنبوب PCR، لأنه بدون غطاء ساخن، يمكن أن تتبخر العينة وتتكثف إلى أعلى الأنبوب حيث تكون درجة الحرارة أكثر برودة.يؤثر تصميم الكتلة الحرارية أيضًا على التحكم في درجة الحرارة؛تعتبر كتل الألومنيوم الخيار الأكثر اقتصادا ولكنها الأقل موصلية، مما يعني أنها ستحقق توحيد درجة الحرارة بشكل أبطأ ولها معدلات انحدار أقل من الكتل الأكثر موصلية.تعد الكتل المطلية بالفضة والذهب أكثر تكلفة ولكنها تسمح بحدوث نقل الحرارة بسرعة أكبر، مما يضمن توزيعًا متساويًا لدرجة الحرارة عبر الكتلة.

يمكن أن تتطلب أهداف الحمض النووي المختلفة درجات حرارة مختلفة لتحقيق أفضل نتائج التضخيم؛على سبيل المثال، تحتاج التسلسلات الغنية بـ GC إلى درجات حرارة أعلى من أجل تمسخها.تتأثر درجات حرارة التلدين المثالية أيضًا بمجموعة من العوامل - في حين يتم تحديد درجات الحرارة لهذه الخطوة عادةً بناءً على درجات حرارة ذوبان البادئات، والاختلافات في درجات حرارة الانصهار بين أزواج البادئات، وتأثير تركيز الكاشف، ودرجة الحموضة وتركيز الملح يمكن أن تكون جميعها جعل تحسين ظروف درجة حرارة التفاعل مهمة معقدة. تم تصميم أجهزة PCR ذات قدرات التدرج في درجة الحرارة للمساعدة في تحسين طرق PCR من خلال السماح باختبار درجات حرارة التلدين المتعددة في تشغيل واحد.اعتمادًا على أنواع وتنوع العينات التي تخطط لتحليلها باستخدام جهاز PCR الخاص بك، قد يكون اختيار أداة ذات إمكانيات التدرج يستحق التكلفة الإضافية لتوفير وقت كبير وتحسين الكاشف للبروتوكولات الجديدة في عمليات تشغيل أقل.

3. الكتل الحرارية

كما ذكرنا سابقًا، يمكن للكتلة الحرارية المستخدمة مع أداة PCR أن تحدث فرقًا في التحكم في درجة الحرارة، لكن تصميم الكتلة - وتصميم الأداة لاستيعاب الكتل المختلفة - يؤثر أيضًا على الإنتاجية وتكاليف المواد الاستهلاكية والمرونة.ستأتي الكتل النموذجية بتنسيق 96-well أو 384-well، على الرغم من توفر تنسيقات أخرى مثل 48-well و1536-well أيضًا.يتيح عدد البئر الأعلى إنتاجية أعلى مع انخفاض أحجام التفاعل، الأمر الذي سيكون في البداية أكثر تكلفة ولكنه في النهاية يخفض سعر كل تفاعل بسبب انخفاض حجم الكاشف المستخدم لكل بئر.إن الأخذ في الاعتبار عدد العينات التي ستقوم بمعالجتها وعدد المرات التي ستستخدم فيها الآلة سوف يؤثر في ما إذا كانت الكتلة الحرارية ذات العدد الجيد المنخفض أو الأعلى ستكون أكثر عملية وفعالية من حيث التكلفة لمختبرك.

تأتي بعض الأدوات بتنسيق كتلة ثابت بينما يسمح البعض الآخر باستخدام كتل قابلة للتبديل، مما يوفر مرونة أكبر للتبديل بين تنسيقات 96 و384 بئرًا أو بين مواد الكتل المختلفة لتطبيقات مختلفة.تستوعب بعض أجهزة التدوير الحرارية أيضًا عدة كتل في نفس الجهاز، مما يتيح تشغيل بروتوكولات مختلفة على مجموعات مختلفة من العينات في نفس الوقت.3 تعمل الكتل ذات الأبعاد 'العالمية' على تعزيز المرونة في استخدام أنابيب أو شرائط أو لوحات PCR بأحجام مختلفة. كما هو مطلوب.

وبسبب الدور الرئيسي لهذا المكون في التحكم في درجة الحرارة، ومعالجة العينات والإنتاجية، ينبغي النظر بعناية في خيارات الكتلة الحرارية عند اختيار دورة حرارية.بالنسبة للمختبرات ذات الحجم المنخفض من العينات، أو تلك التي تقوم بشكل روتيني بتشغيل عدد قليل من المقايسات فقط، قد تكون أدوات الكتلة الثابتة منخفضة التكلفة ذات التنسيق القياسي المكون من 96 بئرًا كافية.ومع ذلك، قد تكون الأدوات المعيارية المرنة مفيدة للمختبرات التي تحتوي على عدد أكبر من البروتوكولات، وأحجام العينات المتفاوتة، والمزيد من المستخدمين الذين يعتمدون على نفس الأداة لإجراء فحوصاتهم الخاصة، بالإضافة إلى المختبرات التي قد ترغب في توسيع طاقتها الإنتاجية في المستقبل.