طرق استخلاص الحمض النووي الحالية

طرق استخلاص الحمض النووي الحالية

الجزء 1

يعد استخراج الحمض النووي (NAE) أحد أهم الخطوات المحورية في البيولوجيا الجزيئية، حيث يتم استخدامه بشكل روتيني في العديد من مجالات العلوم البيولوجية والطبية، حيث يمثل هذا الإجراء نقطة انطلاق في أي مجموعة أدوات تشخيصية جزيئية [1].لقد كان هذا الإجراء الحاسم معروفًا منذ أكثر من قرن وقد تطور بشكل كبير خلال العقود الماضية.ومع ذلك، لا يزال يتعين تحقيق بعض التقدم حتى تترك بروتوكولات NAE إعدادات المختبر إلى 'العالم الحقيقي' لتشخيصات نقطة الرعاية (POC-Dx).

في الوقت الحاضر، من المعروف أن الأحماض النووية داخل الخلايا (NAs) يمكن تصنيفها على نطاق واسع على أنها جينومية (أو كروموسومية)، وبلازميدات، وأنواع مختلفة من RNAs.على الرغم من أن RNAs تمتلك اليوراسيل في حين أن DNA يحتوي على الثيمين، فإن الأحماض النووية تظهر خصائص كيميائية حيوية أساسية مماثلة ولكن قد يكون لها هياكل ثلاثية الأبعاد متميزة تمامًا (الجينوم، البلازميد، الحمض الريبي النووي النقال، mRNA، rRNA، إلخ).ومع ذلك، على الرغم من الاختلافات الهيكلية، يمكن تطبيق الأساليب الأكثر استخدامًا الموصوفة في هذا النص على الحمض النووي في العديد من تنسيقاته التنظيمية (الكروموسومات، البلازميد، وما إلى ذلك)، وكذلك الحمض النووي الريبي (RNA) وأشكاله المتعددة الأبعاد (mRNA، rRNA، tRNA ، ميرنا، الخ) مع تعديلات طفيفة.

يمكن تقسيم NAE تقريبًا إلى أربع خطوات، والتي يمكن تعديلها اعتمادًا على العينة والتطبيقات النهائية: (i) تعطيل الخلايا؛(2) إزالة الدهون الغشائية والبروتينات والأحماض النووية الأخرى، (3) تنقية/ربط الحمض النووي من الجزء الأكبر؛و(رابعا) تركيز الحمض النووي.

يمكن تحقيق تمزق الخلايا أو تفككها بطرق فيزيائية و/أو كيميائية، هدفها الرئيسي هو تعطيل جدار الخلية و/أو الأغشية الخلوية.تعتمد أساليب التعطيل بشكل أساسي على خصائص العينة ولهذا الغرض يتم استخدام مجموعة واسعة من الأدوات والأساليب إما بمفردها أو مجتمعة لتحقيق تعطيل الأنسجة/الخلايا.تعد الإنزيمات التحللية، والعوامل الفوضوية، وأنواع مختلفة من المنظفات هي المكونات الرئيسية للتحلل الكيميائي، في حين أن الطريقة الميكانيكية تعطل الخلايا عن طريق الطحن والقص وضرب الخرزات والصدمات.ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أنه إذا لم تسفر إحدى التقنيات عن نتائج جيدة، فقد يكون هناك أسلوب آخر ناجح.وقد أسفرت أساليب الصدمة التناضحي، في بعض الحالات، عن نتائج أفضل من بروتوكولات تنقية NA الشائعة مثل استخراج الفينول كلوروفورم وضرب الخرزة.ليس فقط تعطيل الخلايا مهمًا لاستخراج الحمض النووي، ولكنه يلعب أيضًا دورًا حاسمًا في صناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية، حيث يمكن استعادة العديد من البروتينات المؤتلفة والمكونات المهمة الأخرى للخلية من خلال هذه العملية.هناك طريقة أخرى لتعطيل الخلايا وهي استخدام طرق مختلفة معًا.ومن الأمثلة الجيدة على ذلك حالة التحلل الأنزيمي، حيث تستخدم العديد من البروتوكولات البروتياز لتحرير NA من سقالة البروتين الواقية.كما أن تعطيل نشاط النيوكلياز الخلوي الذي يتحرر في المحلول من أجل حماية NA الجديد الخالي من البروتين يعد أمرًا بالغ الأهمية.يتم استخدام مزيج من المنظفات والأملاح الفوضوية في محلول واحد لإذابة جدار الخلية و/أو غشاء الخلية وتعطيل الأنزيمات النووية داخل الخلايا.ومن ناحية أخرى، يستخدم الخلل الميكانيكي القوة لاستخراج مكونات الخلية.من الأمثلة الكلاسيكية للطحن في العلوم الحيوية هو استخدام الملاط والمدقة، والذي تم تحسينه في الوقت الحاضر باستخدام النيتروجين السائل (عندما تسمح به العينة).يمكن أيضًا أن تتعطل جدران الخلايا بسبب موجات الصدمة الناتجة عن التغيرات السريعة في الضغط الناتجة عن الصوتنة أو التجويف.الأدوات الميكانيكية الأخرى المتاحة لتعطيل الخلايا هي القص، والتي تستخدم قوة عرضية لإحداث ثقب في الخلية، والضرب بالخرز، والذي يستخدم خرزات زجاجية أو فولاذية مختلفة لتمزيق جدار الخلية القاسي كما ذكرنا..

تشمل طرق NAE استخراج كل من الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) ولكن يمكن وصفها على نطاق أوسع إلى طرق مدفوعة كيميائيًا أو طرق الطور الصلب؛كلاهما يحتوي على الخطوات الأربع المذكورة أعلاه.في الأقسام التالية، سنراجع مبدأ العمل و/أو الأساس المنطقي للطرق الرئيسية المستخدمة في الوقت الحاضر في العلوم البيولوجية والطبية.نظرًا لأن التشخيص الجزيئي يعتمد بشكل كبير على التقنيات التي تبدأ بـ NAE، فسوف نناقش أيضًا بعض الميزات الأساسية للأجهزة المتاحة لـ POC-Dx، والتي تبلغ ذروتها مع التحديات والقيود المتمثلة في تكييف طرق NAE مع الاختبارات التشخيصية في نقطة الرعاية.